Denrée alimentaire
La prise d’essai : 25g ou 25ml d’échantillon (produits laitier, beur, viande) + 225ml d’un milieu d’enrichissement TSE ensuite on prépare les dilutions décimale, ensemencer de différents milieu pour étudier plusieurs paramètre.
1- Recherche et dénombrement des germes totaux
Principe :
A partir des dilutions décimales, prendre aseptiquement1ml et le mettre dans une boite de pétri vide.
Compléter ensuite avec environ 19ml de gélose TDYM préalablement fondue puis refroidie à 45°c puis agiter lentement par mouvement circulaire et de va et vient.
Incuber à 30°c pendant 72h.
Lecture :
Dénombrer toutes les colonies lenticulaires ayant poussé.
Ne dénombrer que les boites contenant plus de 30 et mois de 300 colonies.
2- Recherche et dénombrement des coliformes totaux et fécaux
Les bactéries coliformes appartient à la famille des entérobactériaceae et signent le plus souvent une contamination fécale.
Elles fermentent rapidement le lactose avec dégagement du gaz.
Le dénombrement permet d’apprécier :
-L’importance des contaminations
-Le risque d’une présence des germes pathogènes.
La présence des coliformes constitue ainsi l’indice d’une contamination par défaillance technologique ou hygiénique
ü Test de présomption : recherche des C.T
Principe :
Préparer une séries de tubes de VBL +cloche :
Trois tubes de VBL +cloche pour chaque dilution.
Chaque série d 3trois tubes sera ensemencer avec 1ml de la dilution décimale correspondante
Incuber à 37°c pendant 24h à 48h.
Lecture :
Après la période d’incubation, les tubes présentent :
- d’une part un dégagement de gaz dans la cloche et d’autre part un trouble microbien, sera considéré comme positifs.
Il y a donc présence de CT et les résultats sera exprimé par le NPP selon l a table de MAC GRADY.
ü Test de confirmation C.F (E.coli)
Principe
Chaque tube de VBL positif, sera repiqué (3à4 gouttes) sur :
- d’une part un autre tube de VBL +cloche
- d’autre part sur un tube d’eau peptonnée exempte d’indole.
Cette 2ème série de tubes incubés à 44°c pendant 24h.
Lecture :
- Les tubes de VBL positifs auront la même allure que les 1ers
- sur les tubes d’eau péptonnée , ajoutée 2à3 gouttes du réactif de KAWACS. S’il y a apparition d’anneau rouge en surface, celui-ci gémoigne de la production d’indole par les C.F (E.coli)
Dans le cas contraire, il n’y aura pas de réaction ceci indique l’absence des C.F dans le
produit analysé. Attia mehdi
En tenant du fait que (E.coli) présente 2 caractères : gaz et indole, le résultat sera exprimé selon la table de MAC GRADY.
Recherche et dénombrement des salmonella
Principe
 1er jour : pré enrichissement
Cette recherche nécessite une pesée à part de 24kg du produit à analyser qu’on doit diluer dans 225ml de T.S.E
On incube le tout à 37°c pendant 24h
2ème jour : enrichissement
Le lendemain, on effectue un enrichissement sur SFB D/C ou SFB S/C auxquels on doit rajouter avant une ampoule de sélénite D/C ou S/C
L’enrichissement se fait soit :
-100ml de la suspension incubée le 1er jour le SFB D/C
-10ml de la suspension incubée le 1er jour le SFB S/C
3ème jour : isolement sur milieu Hectoen
A partir de chacune des deux concentrations du SFB, on effectue des isolements sur Hectoen qu’on incube à 37°c pendant 24h.
4ème jour : identification
A partir de la boite d’Hektoen, on repère chaque colonie suspecte, lactose négatif et on l’ensemence sur milieu T.S.I
L’incubation se fait à 37°c pendant 24h
Les colonies suspectes ayant poussé sur Hectoen du 2ème isolement subiront une identification biochimique à partir d’une GN inclinée à l’aide de galerie API 20E et un TSI et une identification antigénique à l’aide des sérums OMA et OMB…
Attia mehdi
3- Recherche et dénombrement des staphylococcus
Principe :
Nous avons introduit 1ml de chaque dilution dans des tubes secs stériles, puis on a ajouté dans chacun 15ml environ du milieu Giolliti-Cautoni auquel nous avons ajouté au préalable 15ml de bellurite de potassium
Incuber à 37°c pendant 48h
Lecture :
Après 48h d’incubation, les tubes ayant viré au noir seront considérés comme + et seront isolés sur milieu de Chapman préalablement fondu, coulé en boites de pétri qui à leur tour seront incubés à 37°c pendant24 à 48h.
Après ce délai on repère les colonies suspectes : les staphylococcus se présentent sous forme de colonies de taille moyenne, lisses et pigmentées en jaune. On effectue une réaction catalase sur ce type de colonies.
Recherche de la catalase :
Principe :
La catalase est une enzyme du système respiratoire présente chez les bact qui ont un métabolisme oxydatif
Elle décompose l’eau oxygénée
Technique :
Déposer une suspension de colonie âgée de 18h à 24h en croissance sur gélose sur une lame propre.
Mettre au dessus une goutte d’eau oxygénée à 10 volumes à l’aide d’une pipette pasteur.
Lecture
Si la souche bactérienne possède un catalase, on observe un dégagement immédiat de bulles gazeuses, la bactérie est dite catalase (+).
Dans le cas différents, il n y a pas de réaction ceci indique que la bactérie est catalase (-).
En tenant compte fait que les staphylocoques comme les microcoques ont une catalase (+)
Ce qui différencient des staphylocoques qui sont catalase (-).
Le caractère de pathogénique est confirmé ensuite par le test de staphylocoagulase à l’aide du plasma de lapin lyophilisé.
Recherche de la coagulase :
Principe :
Le plasma de lapin lyophilisé est destiné à la recherche d’une enzyme qui est staphylo- coagulase capable de coaguler le plasma de lapin, sa mise en évidence permet l’identification de l’espèce. S.aureus.
Technique :
A partir du milieu sélectif de CHAPMAN ou on a constaté un virage du milieu au jaune, en ensemence un bouillon spécial pour épreuve de la coagulase, le lendemain introduire dans un tube à hémolyse 0.5ml de l ml culture en bouillon de souche datant de 18 à 24h et 0.5ml de plasma de lapin lyophilisé reconstitué (1.5ml d’eau physiologique ou distillée est additionnée au plasma), le tube est incubé à 37°c, 24h.
Lecture :
En un temps variant entre 21h et 24h, on voit si :
Ø on a formation d’un coagulum, la bactérie est dite coagulase (+)
Ø en cas d’absence de coagulum, la bactérie est dite coagulase (-).
Attia mehdi
4- Recherche et dénombrement des clostridium sulfito-réducteurs
Principe :
Recherche des clostridiums SR peut s’effectuer par dénombrement des formes sporulées, elle est basé sur :
Ø une croissance dans des milieux contenant du sulfite de sodium.
Ø Leur pouvoir de réduire le sulfite de Na et de donner en présence de fer du sulfure de fer d’où une colonie noire autour de la colonie suspecte.
Technique :
On prend aseptiquement 5ml de la solution mère qu’on répartit dans 4 tubes secs stériles qui sont portés au bain-marie à80°c pendant 10min afin d’éliminer toutes les formes végétatives éventuellement présentent puis refroidir immédiatement à l’eau de robinet.
Ajouter ensuite environ 20ml de Gélase VF fondue puis refroidie à45°c. Additionnée d’une ampoule d’alun de fer et d’une demi ampoule de suffite de sodium, est ensuite coulée dans les tubes.
Laisser solidifier sur la paillasse, puis incuber à 37°c pendant 48h.
La présence des colonies noires caractérise le développement des clostridium, SR.
Les colonies suspectes subiront une identification biochimique à l’aide de galerie API 20A.
Le 1er dénombrement des colonies se fait à16h puis 24h puis 48h (ce sera le nombre de spores de clostridium contenus dans 5ml de la suspension mère de départ).
Faire le calcul final en tenant compte éventuellement du facteur de dilution.
Donner le résultat en nombre de spores de clostridiums par grammes ou ml de produit à analyser.
Ces germes ont la propriété de réduire le suffite de sodium en présence d’un clonnteur d’hydrogène pour former l’H2S qui attaque le fer du milieu.
Exemple :
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Dilution
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1ère lecture 16h
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2ème lecture 24h
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3ème lecture 3ème 48h
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-1
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3
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5
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On peut pas
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-1
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4
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Envahissement
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/
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-2
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5
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12
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/
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-2
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0
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2
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/
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On tient compte de la 1ère culture :
La moyenne X : X=6+4 = 3,5
2
La moyenne Y : Y=5+0 = 2,5
2
La moyenne Z entre X et Y : Z=3
Puis on multiplie par l’inverse de la première dilution 3x10=30 spores de clostridium S.R dans 5ml de la solution mère de départ.
Attia mehdi
5- Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux
Principe :
ü 1-test de présomption :
Pour chaque dilution, on ensemence 3tubes contenant le milieu Rothe S/C à raison de 1ml dans chaque tube. L’incubation se fait à37°c pendant 24 à 48h.
Lecture :
Après la période d’incubation les tubes de Rothe présentent un trouble microbien seront considérés comme positifs.
ü 2-test de confirmation :
Principe :
Pour confirmer les résultats, il est indispensable de repiquer 3gouttes de chaque tube de Rothe trouvé positif sur un second milieu plus sélectif : le milieu de Litsky-Eva.
L’incubation se fait à 37°c pendant 24 à 48h.
Lecture :
Seront considérés comme+, les tubes d’Eva présentent :
ü D’une part un trouble microbien
ü D’autre part une pastille blanchâtre au fond du tube
Il y a donc présence de Streptoroques fécaux dans le produit analysé mais dans le cas contraire, on aura absence de Streptoroques fécaux. Et le résultat final sera exprimé par le NPP selon table de Mac Grady.
Attia mehdi
6- Recherche et dénombrement des levures et moisissures
Principe :
Pour le dénombrement des levures et des moisissures on a réalisé un étalement de 4 gouttes de chaque dilution à l’aide d’un rateau préparé avec une pipette pasteur stérile sur les boites de pétri contenant le milieu OGA préalablement fondu, coulé en boites puis sécher. On incube le tout à la température ambiante pendant 5 jours.
On fait de la même manière une boite témoin à l’aide de 4 gouttes de TSE (diluant) et une boite témoin du milieu incubée telle quelle.
Lecture :
Après 5 jours d’incubation à 20°c, on commence par lire les 2 boite témoins.
Si sur l’une d’entre elles, on retrouve des levures ou des moisissures l’analyse est refaire, car le milieu OGA ou le diluant sont contaminés.
Dans le cas contraire, on dénombre les levures à par et les moisissures à part, puis rapporter le chiffre trouvé à 1ml en le multipliant par 5, puis multiplier par l’inverse de la dilution correspondante pour avoir le résultats final selon la formule suivante :
  1ml 20 gouttes
 X ml 4 gouttes X =0.2ml
Pour revenir à 1ml on multiplie le X ml par 5
Nombre de levures
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